La Galleria occupa interamente il primo e secondo piano del grande edificio costruito tra il 1560 e il 1580 su progetto di Giorgio Vasari: è uno dei musei più famosi al mondo per le sue straordinarie collezioni di sculture antiche e di pitture (dal Medioevo all'età moderna). Le raccolte di dipinti del Trecento e del Rinascimento contengono alcuni capolavori assoluti dell'arte di tutti i tempi: basti ricordare i nomi di Giotto, Simone Martini, Piero della Francesca, Beato Angelico, Filippo Lippi, Botticelli, Mantegna, Correggio, Leonardo, Raffaello, Michelangelo, Caravaggio, oltre a capolavori della pittura europea, soprattutto tedesca, olandese e fiamminga. Non meno importante nel panorama dell'arte italiana la collezione di statuaria e busti dell'antichità della famiglia Medici. La collezione abbellisce i corridoi della Galleria e comprende sculture romane antiche, copie da originali greci andati perduti.

L’edificio, commissionato da Cosimo I de’ Medici, primo Granduca di Toscana, fu concepito per ospitare gli “uffizi”, ovvero gli uffici amministrativi e giudiziari di Firenze. Cosimo affidò l’impresa al suo artista di fiducia, Giorgio Vasari, che progettò un edificio con portico a colonne doriche e dall’aspetto insieme elegante e severo, fondato “in sul fiume e quasi in aria”.
La costruzione a partire dal 1560 dell’edificio delle Magistrature, originaria denominazione del complesso, comportò demolizioni e il risanamento del rione di Baldracca, quartiere in cui sorgeva l’omonima, malfamata taverna.
Vasari risolse brillantemente i problemi imposti dallo spazio limitato adottando soluzioni di grande impatto scenografico.